2.5 Protamex酶水解對玉米谷蛋白表面疏水性的影響

蛋白質(zhì)表面疏水性是維持其空間結(jié)構(gòu)、界面性質(zhì)及分子間相互作用力的重要因素。由表1可知，Protamex酶水解物的表面疏水性顯著升高（P＜0.05），隨著水解時(shí)間的延長，表面疏水性指數(shù)持續(xù)增加。在蛋白質(zhì)天然構(gòu)像中，一部分疏水性氨基酸會(huì)埋藏在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部，而經(jīng)過水解后谷蛋白分子結(jié)構(gòu)變得松散、舒展，使原本包埋于分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露于表面，疏水基團(tuán)暴露的增多使得疏水性增強(qiáng)，分子柔性增大，這有利于蛋白質(zhì)在界面上吸附速率的升高從而提高起泡性。與內(nèi)源熒光光譜的結(jié)果一致，150 min水解物的表面疏水性顯著高于其他樣品，但其起泡力和泡沫穩(wěn)定性均降低，這可能是由于此時(shí)谷蛋白分子的其他性質(zhì)因素變化對其泡沫性質(zhì)的消極作用更顯著。

2.6 Protamex酶水解對玉米谷蛋白拉曼光譜的影響分析

由圖5可知，玉米谷蛋白及其Protamex酶水解物的拉曼光譜在酰胺I帶（1 600～1 700 cm-1）和酰胺III帶（1 230～1 350 cm-1）均有屬于肽鍵（—CO—NH—）的振動(dòng)模式，酰胺I帶振動(dòng)模式主要源于肽基平面內(nèi)C＝O伸縮振動(dòng)和較小程度的N—H彎曲振動(dòng)，并且水解物的在1 650 cm-1附近和1 290 cm-1附近的譜峰的強(qiáng)度與玉米谷蛋白相比有所減弱，反映了水解后蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。波數(shù)1 004 cm-1歸屬于苯丙氨酸苯環(huán)伸縮振動(dòng)，由于該譜峰受外界環(huán)境影響小而被作為歸一化因子。850 cm-1和830 cm-1附近的譜帶為酪氨酸雙峰帶，760 cm-1附近的譜帶為色氨酸吲哚環(huán)的振動(dòng)，其譜峰強(qiáng)弱反映了其所處微環(huán)境的變化情況。

圖5不同水解時(shí)間玉米谷蛋白的拉曼光譜

2.6.1 Protamex酶水解對玉米谷蛋白主鏈構(gòu)象分析

通常利用酰胺I帶（1 600～1 700 cm-1）對各蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行定量分析。酰胺I帶拉曼光譜峰的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋（1 650～1 660 cm-1）、無規(guī)卷曲（1 661～1 665 cm-1）、β-折疊（1 666～1 680 cm-1）及β-轉(zhuǎn)角（1 681～1 690 cm-1）附近等構(gòu)成。由圖6可知，玉米谷蛋白中α-螺旋結(jié)構(gòu)含量最高（39.56%），β-折疊和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量相似（21%左右），無規(guī)卷曲含量最低（17.99%）。Protamex酶水解物中α-螺旋結(jié)構(gòu)含量顯著降低，在酶解120 min時(shí)達(dá)到最低（26.07%）。隨著水解時(shí)間的延長，β-折疊結(jié)構(gòu)含量無明顯變化，無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)含量逐漸增加，β-轉(zhuǎn)角含量顯著增加（除150 min酶解物）。這說明Protamex酶水解使玉米谷蛋白的有序結(jié)構(gòu)向無序結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，分子柔性增加。Yong Yehui等在PG酶處理麥谷蛋白后發(fā)現(xiàn)其的二級結(jié)構(gòu)更加靈活，同時(shí)也伴隨著β-轉(zhuǎn)角含量增加的現(xiàn)象。α-螺旋結(jié)構(gòu)含有較多氫鍵，而玉米谷蛋白水解物中蛋白質(zhì)/多肽表面所帶同種電荷增多也會(huì)導(dǎo)致氫鍵斷裂使得α-螺旋結(jié)構(gòu)減少。本研究中玉米谷蛋白質(zhì)分子無序結(jié)構(gòu)增加，分子柔性增強(qiáng)，利于分子內(nèi)部的疏水性氨基酸暴露，提高蛋白質(zhì)的疏水性，從而達(dá)到改變起泡性和泡沫穩(wěn)定性的目的。但水解時(shí)間延長至150 min無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)含量顯著高于β-折疊結(jié)構(gòu)，此時(shí)玉米谷蛋白水解物的起泡性和泡沫穩(wěn)定性均有降低，這可能說明高比例的無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)不利于玉米谷蛋白在界面形成穩(wěn)定的界面膜。

圖6水解時(shí)間對玉米谷蛋白二級結(jié)構(gòu)含量的影響

2.6.2 Protamex酶水解對玉米谷蛋白側(cè)鏈構(gòu)象分析

酪氨酸雙峰帶位于850 cm-1和830 cm-1附近的譜帶，是酚羥基的氫鍵的良好指標(biāo)。通常用酪氨酸雙峰的羥苯基環(huán)的呼吸振動(dòng)和環(huán)平面外彎曲振動(dòng)倍頻之間費(fèi)米共振譜線的相對強(qiáng)度比（I850/I830）反映氫鍵狀態(tài)和酪氨酸側(cè)鏈中酚羥基的電離狀態(tài)，判定蛋白質(zhì)中酪氨酸殘基的暴露或者埋藏情況。當(dāng)I850/I830＞1.0時(shí)，表明酪氨酸殘基暴露于水相環(huán)境，能夠參與溫和的或者微弱的氫鍵作用，而I850/I830＜1.0時(shí)，表明酪氨酸殘基埋藏在疏水環(huán)境，傾向于充當(dāng)氫鍵供體，起到增強(qiáng)氫鍵的作用。如圖7所示，本研究中玉米谷蛋白的I850/I830為0.58，表明酪氨酸殘基埋藏于分子內(nèi)部。當(dāng)Protamex酶水解60 min以后，I850/I830均＞1.0，此時(shí)酶解物中酪氨酸殘基呈“暴露”態(tài)。這與本研究中疏水相互作用的結(jié)果相符（表1）。

圖7水解時(shí)間對玉米谷蛋白I850/I830和I760的影響

色氨酸殘基的吲哚環(huán)伸縮振動(dòng)會(huì)在760 cm-1附近產(chǎn)生光譜，代表色氨酸芳香基的局部環(huán)境的變化，埋藏殘基比暴露在極性環(huán)境中的殘基表現(xiàn)出更強(qiáng)的760 cm-1帶強(qiáng)度。由圖7可知，隨水解時(shí)間延長，水解物的I760強(qiáng)度逐漸降低。這說明酶解使色氨酸殘基逐漸趨向于“暴露”態(tài)，疏水相互作用增強(qiáng)提高了蛋白質(zhì)的表面疏水性，這與內(nèi)源熒光光譜和表面疏水性的結(jié)果一致。江連洲等利用Protex6L酶制劑水解大豆蛋白得到了相似結(jié)論，水解可使大豆蛋白分子表面色氨酸、酪氨酸殘基等暴露增多。

2.7 Protamex酶水解對玉米谷蛋白靜態(tài)流變學(xué)性質(zhì)的影響

蛋白溶液的流變學(xué)特性是評價(jià)蛋白質(zhì)氣/水界面性質(zhì)的重要指標(biāo)。由圖8可知，玉米谷蛋白及其水解物分散液的表觀黏度隨著掃描頻率的增加而逐漸減小，表現(xiàn)為剪切稀釋的流變特性，所有樣品均為非牛頓假塑性流體。這說明水解作用沒有改變谷蛋白分散液的流變行為。同時(shí)，樣品分散液的表觀黏度與剪切速率能夠較好地?cái)M合牛頓冪律方程，即R2＞0.95（表2）。

表2不同水解時(shí)間的玉米谷蛋白水解物流變學(xué)擬合參數(shù)

圖8水解時(shí)間對玉米谷蛋白的表觀黏度的影響

根據(jù)牛頓冪律方程，K值為黏度系數(shù)，代表了流體的黏稠程度，K值越大代表流體越黏稠。由表2可知，K值的變化趨勢與圖8表觀黏度一致，呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，水解120 min樣品的K值達(dá)到最大，比玉米谷蛋白增加了67%。這一方面是由于酶水解使玉米谷蛋白的粒徑減小、溶解性顯著提高。另一方面，與天然玉米谷蛋白相比，水解物中的蛋白質(zhì)/多肽的結(jié)構(gòu)趨于無序、分子柔性更大、表面凈電荷降低。這都有了利于增強(qiáng)蛋白質(zhì)的水合能力，使得復(fù)水后蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用增強(qiáng)，表現(xiàn)為表觀黏度增強(qiáng)。因此，Protamex酶對玉米谷蛋白的適當(dāng)水解提高了其水解物中可溶性蛋白質(zhì)分子定向吸附能力，是其起泡性改善的關(guān)鍵因素。但水解150 min，酶解物的表觀黏度下降，這是由于過度水解導(dǎo)致水解物中蛋白質(zhì)/多肽的粒徑持續(xù)降低、無序結(jié)構(gòu)增加、靜電斥力增大等導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶液流動(dòng)性增強(qiáng)，分子間相互作用減弱。N為流動(dòng)指數(shù)，代表液體的流動(dòng)性能，表2中水解150 min樣品的n顯著高于其他樣品，這也表明了此時(shí)分散液的流動(dòng)性最大。

3結(jié)論

采用Protamex酶水解玉米谷蛋白，通過控制水解時(shí)間能夠顯著提高玉米谷蛋白的泡沫性質(zhì)。當(dāng)水解時(shí)間120 min，水解物的起泡性和泡沫穩(wěn)定性最高，分別為（350.57±2.83）%和（228.39±2.90）%，且氣泡細(xì)小均勻、蛋白膜較厚。此時(shí)水解物的溶解性較佳、表觀黏度值最高。適當(dāng)?shù)乃庖环矫媸褂衩坠鹊鞍兹芙庑蕴岣?、表面張力降低、分子尺寸減??；另一方面使谷蛋白的α-螺旋含量降低、無規(guī)卷曲與β-轉(zhuǎn)角含量增加、疏水性氨基酸殘基暴露，進(jìn)而使分子柔性增強(qiáng)、表面凈電荷減少、表面疏水性增強(qiáng)。這有利于玉米谷蛋白水解物中蛋白質(zhì)分子/多肽持續(xù)吸附在界面之上，在氣泡之間可形成有一定黏彈性的保護(hù)層，促進(jìn)泡沫的形成以及維持泡沫體系的穩(wěn)定。然而持續(xù)水解至150 min導(dǎo)致水解物中蛋白質(zhì)/多肽分子尺寸持續(xù)降低、結(jié)構(gòu)過度變形即無規(guī)卷曲含量顯著高于β-轉(zhuǎn)角含量及表面凈電荷增加，這導(dǎo)致水解物的氣泡間的蛋白膜出現(xiàn)流體排水現(xiàn)象，使得界面膜破裂，氣泡將逐漸靠近聚合，即起泡性和穩(wěn)定性下降。本研究對蛋白酶水解改善玉米谷蛋白和其他植物蛋白起泡性等功能性質(zhì)的應(yīng)用和研究提供了一定的理論依據(jù)，為玉米蛋白的高值化利用提供參考。