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生物表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選及對(duì)PAHs污染環(huán)境的修復(fù)效果研究(三)
來(lái)源:農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào) 瀏覽 525 次 發(fā)布時(shí)間:2025-07-31
2結(jié)果與討論
2.1生物表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選和鑒定
經(jīng)過(guò)血平板初篩得到25株菌株,表1是表面張力儀復(fù)篩結(jié)果??梢园l(fā)現(xiàn)147號(hào)細(xì)菌發(fā)酵液的張力值明顯低于其他菌株,選擇147細(xì)菌作為目標(biāo)菌株。
觀察菌株培養(yǎng)特征及形態(tài)特征,可見菌體細(xì)長(zhǎng)且長(zhǎng)短不一,菌落較小,為扁平、濕潤(rùn)的菌落。部分生理生化指標(biāo)如表2。經(jīng)16S rDNA測(cè)試并與GenBank中已登錄的核苷酸序列號(hào)進(jìn)行同源性比較,發(fā)現(xiàn)菌株147與Pseudomonas aeruginosa DSM50071同源性為99%,采用MEGA 5.10軟件NJ方法構(gòu)建147的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1。結(jié)合生理生化特征結(jié)果,將菌株147鑒定為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa),該菌株GenBank登錄號(hào)為KU921686。
表1細(xì)菌復(fù)篩結(jié)果
表2 147菌株的生理生化特性
2.2147細(xì)菌產(chǎn)生表面活性劑的物質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定
通過(guò)薄層色譜分析顯示,苯酚-硫酸試劑有棕色斑點(diǎn),加入茚三酮顯色劑則無(wú)明顯變化。這說(shuō)明該菌株主要產(chǎn)糖脂類生物表面活性劑,不產(chǎn)生或者產(chǎn)生少量的脂肽類物質(zhì)。
將菌株147產(chǎn)物提純,紅外光譜儀(FT-IR)分析物質(zhì)結(jié)構(gòu),結(jié)果如圖2。該物質(zhì)在3701.72cm-1處有吸收峰,表明分子中有羥基存在;2 858.77~2 927.56 cm-1處的吸收峰表明存在糖類C-H的伸縮振動(dòng),1400~1200 cm-1處是C-H變角振動(dòng),1 734.39 cm-1處是C=O的雙鍵振動(dòng),而1 070.04 cm-1處為C-O-C鍵伸縮振動(dòng),因此該物質(zhì)中有一個(gè)五元環(huán)狀內(nèi)酯和糖苷鍵存在。由此進(jìn)一步證明該生物表面活性劑含糖脂類物質(zhì)。
發(fā)酵產(chǎn)物臨界膠束濃度是指分子在溶劑中締合形成膠束的最低濃度。臨界膠束濃度(Critical micelle0.005 concentration,CMC)可以作為表面活性劑表面活性的一種度量,CMC越小,改變表/界面性質(zhì),起到增溶、乳化等所需的濃度就越低。從圖3可以看出:糖脂在0~300 mg·L-1時(shí),表面張力值隨著糖脂濃度的升高而降低,且在300 mg·L-1時(shí)達(dá)到最小值;在300~500 mg·L-1時(shí),表面張力值變化不大??傻冒l(fā)酵粗提產(chǎn)物的CMC為300 mg·L-1,明顯低于普通化學(xué)表面活性劑十二烷基磺酸鈉(SDS)的2200 mg·L-1,能在較低濃度下使用,因而在醫(yī)藥、食品、化工等行業(yè)具有廣闊應(yīng)用前景。
圖1 147菌株16S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹
圖2 147菌株產(chǎn)的生物表面活性劑紅外光譜圖
圖3不同濃度生物表面活性劑溶液的表面張力
2.3147細(xì)菌發(fā)酵條件優(yōu)化
2.3.1碳源的影響
碳源對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)與發(fā)酵產(chǎn)物量有重要影響。銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)可在多種類型碳源下產(chǎn)生生物表面活性劑,包括甘油、乙醇、植物油等。由表3可知,以花生油為碳源,細(xì)菌發(fā)酵液的降低值為39.12 mN·m-1,明顯高于其他碳源類型;乳化值為34.17%,稍高于其他碳源,此時(shí)細(xì)菌生物量最大,糖脂含量最高,為0.30 g·L-1。雖然花生油作為碳源,能夠促進(jìn)菌株產(chǎn)生更多生物表面活性劑,但如果用于實(shí)際生產(chǎn),成本相對(duì)較高,近年來(lái)一些研究者嘗試使用成本較低的工業(yè)副產(chǎn)物如糖蜜、廢潤(rùn)滑油等作為碳源,發(fā)現(xiàn)也具有很好的促進(jìn)微生物產(chǎn)生生物表面活性劑的作用。因此,后期會(huì)考慮選擇用一些低成本碳源進(jìn)行發(fā)酵。
2.3.2氮源的影響
細(xì)胞表面的物質(zhì)合成需要氮源,氮源的種類會(huì)對(duì)細(xì)菌細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量產(chǎn)生很大影響。由表4可以看出,不同氮源對(duì)細(xì)菌發(fā)酵過(guò)程中表面張力降低值的影響較小,可能與發(fā)酵液中的生物表面活性劑含量已經(jīng)達(dá)臨界膠束濃度(CMC)有關(guān)。當(dāng)?shù)礊榱蛩徜@時(shí)發(fā)酵液表面張力降低值最大,同時(shí)乳化性、細(xì)菌干重、糖脂含量均達(dá)到最大值。這與錢曉勇等研究結(jié)果一致,硫酸銨是促進(jìn)生物表面活性劑生成的較好氮源。
表3碳源對(duì)147細(xì)菌生長(zhǎng)以及生物表面活性劑產(chǎn)量的影響
表4氮源對(duì)147細(xì)菌生長(zhǎng)以及生物表面活性劑產(chǎn)量的影響
2.3.3碳氮比的影響
由表5可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)碳氮比在5以上時(shí),表面張力降低值與乳化性變化不大,而細(xì)菌干重與生物表面活性劑含量卻明顯不同,說(shuō)明當(dāng)碳氮比大于5時(shí),該菌株生物表面活性劑產(chǎn)量已經(jīng)超過(guò)臨界膠束濃度。細(xì)菌干重在碳氮比為25時(shí)最大,為2.58±0.09 g·L-1,同時(shí)生物表面活性劑含量也達(dá)到最大,為1.74±0.01 g·L-1。這與Saimmai等研究結(jié)果一致,25是147菌株的最適生長(zhǎng)碳氮比,此時(shí)細(xì)菌的生物量達(dá)到最高,生物表面活性劑產(chǎn)量也最高。





