3.結(jié)果

3.1.體外抗癌能力和選擇性

G（IIKK）nI-NH2（n?1e4）肽是通過(guò)Fmoc固相肽合成協(xié)議[9e11]合成的。CD研究表明，這些肽主要存在于緩沖溶液中的無(wú)序結(jié)構(gòu)中。在添加到DPPG（二棕櫚酰磷脂酰甘油）SUV（模擬帶負(fù)電荷的細(xì)菌和癌細(xì)胞膜的小單層囊泡）中后，除了GIIKKI-NH2外，肽采用a-螺旋構(gòu)象。兩親螺旋結(jié)構(gòu)有利于它們與脂質(zhì)雙層的相互作用，但GIIKKI-NH2始終保持未折疊狀態(tài)，無(wú)論周圍環(huán)境發(fā)生任何變化。二級(jí)結(jié)構(gòu)的這種缺乏變化與其缺乏生物活性很好地一致。隨后的細(xì)胞研究集中于n?2、3和4的系列。

按照濃度依賴性模式，重復(fù)次數(shù)較多或長(zhǎng)度較長(zhǎng)的肽在殺死癌細(xì)胞（HeLa和HL60細(xì)胞）方面更有效，但對(duì)正常細(xì)胞（紅細(xì)胞和HDFa細(xì)胞）的體外毒性也開(kāi)始增加，如圖1aec所示。總的來(lái)說(shuō)，就體外抗癌活性和細(xì)胞選擇性而言，G（IIKK）3I-NH2是最佳序列，其對(duì)HeLa和HL60細(xì)胞的IC50值為15和25 mM，EC50遠(yuǎn)大于250 mM（IC50：濃度導(dǎo)致50%的癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制；EC50：濃度誘導(dǎo)50%的紅細(xì)胞溶解）。重要的是，HDFa細(xì)胞對(duì)這些肽有良好的耐受性，例如，在濃度低于50 mM時(shí)，G（IIKK）3I-NH2對(duì)HDFa細(xì)胞的影響微不足道（圖1c）。我們合理設(shè)計(jì)的短肽的這種性能明顯優(yōu)于天然AMP，如馬蓋寧和蜂毒素，并且在有效性、選擇性甚至耐藥性方面也優(yōu)于抗癌藥物順鉑[12e15]。例如，在類似的實(shí)驗(yàn)條件下，magainin-2對(duì)HeLa細(xì)胞的IC50低于60 mM，而蜂毒肽在5 mM下的EC50則低得多，顯示出對(duì)宿主細(xì)胞的高毒性[12e14]。

圖1。設(shè)計(jì)的a-螺旋肽的細(xì)胞毒性和選擇性。（a）對(duì)HeLa和HL60細(xì)胞的細(xì)胞毒性。（b）人類紅細(xì)胞溶血。（c）對(duì)HDFa細(xì)胞的細(xì)胞毒性。（d）FITC-G（IIKK）3I-NH2在含有HL60癌細(xì)胞和HDFa原代細(xì)胞的體外共培養(yǎng)系統(tǒng)中的分布。

然后，我們進(jìn)一步評(píng)估了基于體外共培養(yǎng)系統(tǒng)的細(xì)胞選擇性，該系統(tǒng)包含HL60癌細(xì)胞和HDFa原代細(xì)胞，它們與體內(nèi)環(huán)境非常相似[8]。將最終濃度為20 mM的FITC-G（IIKK）3I-NH2添加到系統(tǒng)中，培養(yǎng)1 h后，用熒光顯微鏡觀察兩種細(xì)胞中的肽分布（圖1d）。很明顯，綠色熒光集中在懸浮和圓形HL60細(xì)胞中，而不是粘附和紡錘形HDFa細(xì)胞中，這再次表明肽具有良好的細(xì)胞選擇性，以及對(duì)癌細(xì)胞的快速識(shí)別。

3.2.肽與脂質(zhì)單層的選擇性相互作用

在這個(gè)階段，這些肽的選擇性背后的機(jī)制過(guò)程在很大程度上仍不清楚，但抗癌肽主要是膜活性的，它們對(duì)癌細(xì)胞的作用方式涉及膜破壞。此外，它們對(duì)癌細(xì)胞的選擇性殺傷與癌細(xì)胞的兩個(gè)關(guān)鍵細(xì)胞膜特征密切相關(guān)，即凈負(fù)表面電荷和更大的膜流動(dòng)性[2,3,16]。為了了解肽和細(xì)胞膜之間的特殊相互作用以及分子水平上抗癌作用的基本過(guò)程，我們轉(zhuǎn)向使用脂質(zhì)單層的膜模型。圖2a顯示了在最終濃度為3 mM的條件下，將G（IIKK）（2e4）I-NH2注入亞相時(shí)，DPPC（二棕櫚酰磷脂酰膽堿）和DPPG單層（分別模擬正常哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞和癌細(xì)胞外膜）的表面壓力從不同的初始表面壓力（pi）增加（Dp），同時(shí)保持表面積不變。所有的肽都表現(xiàn)出對(duì)帶負(fù)電荷的DPPG單層的明顯偏好，而對(duì)兩性離子DPPC單層的親和力則要小得多。在Dp?0處對(duì)每個(gè)壓力圖進(jìn)行外推，得出排除壓力，超過(guò)該壓力，肽不再能夠穿透脂質(zhì)單層，從而導(dǎo)致表面壓力進(jìn)一步增加。對(duì)于兩性離子DPPC單層，G（IIKK）2I-NH2的排斥壓力為23.4 mN/m，遠(yuǎn)低于生物膜的30e35 mN/m生理范圍[17,18]，這與其對(duì)紅細(xì)胞的毒性很小相符。相比之下，G（IIKK）（3e4）I-NH2的值分別增加到32.0和37.6 mN/m，這與它們的溶血活性增加一致。另一方面，對(duì)于帶負(fù)電荷的DPPG單層，排斥壓力分別顯著增加至37.3、40.6和42.6 mN/m，表明陽(yáng)離子肽電荷和陰離子脂質(zhì)頭基團(tuán)之間的靜電相互作用起著關(guān)鍵作用。盡管DPPC和DPPG單分子膜對(duì)G（IIKK）2I-NH2的排斥壓差較大（參見(jiàn)補(bǔ)充數(shù)據(jù)，圖S1），但其對(duì)后者的排斥壓僅略高于生物膜30e 35 mN/m的生理范圍，這與其殺死癌細(xì)胞的效率較低一致，因此，這種肽在癌癥治療中沒(méi)有吸引力。另一方面，G（IIKK）4I-NH2對(duì)兩性離子DPPC單分子膜的排斥壓力為37.6 mN/m，略高于30e35 mN/m的生理范圍，這與該系列中表現(xiàn)出的最高溶血能力一致。G（IIKK）3I-NH2顯示出中間值，DPPC單層的Dp值為32.0 mN/m，DPPG單層的Dp值為40.6 mN/m，這與體外細(xì)胞工作中的最佳細(xì)胞選擇性一致。

圖2。肽與不同脂質(zhì)單層的相互作用。（a）當(dāng)肽以3 mM濃度注入亞相時(shí)，在不同初始表面壓力（pi）下，DPPC和DPPG單分子膜的表面壓力增加（Dp）。（b）將G（IIKK）3I-NH2注入DPPC和POPC單分子膜的亞相后的表面壓力與時(shí)間的關(guān)系。

癌細(xì)胞中膽固醇水平的降低和具有不飽和脂肪酰鏈的脂質(zhì)的增加可能是膜流動(dòng)性增加的原因[19]。將最終濃度為3 mM的G（IIKK）3I-NH2注入亞相后，飽和DPPC和不飽和棕櫚酰油酰磷酰膽堿（POPC）單分子膜的平衡表面壓力增加趨于3.5和10 mN/m，初始表面壓力為30 mN/m（圖2b），表明無(wú)論膜電荷相互作用如何，增加的膜流動(dòng)性確實(shí)有利于表面活性肽的膜滲透。

3.3.肽的原位定位和質(zhì)膜完整性

為了在與HeLa細(xì)胞孵育期間精確定位抗癌肽，使用濃度為10 mM的FITC-G（IIKK）3I-NH2，并使用激光共聚焦顯微鏡觀察其在這些細(xì)胞中的熒光分布，與孵育時(shí)間有關(guān)。孵育1小時(shí)后，大部分FITC衍生信號(hào)（綠色（網(wǎng)絡(luò)版））位于HeLa細(xì)胞膜上，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)觀察到相對(duì)較弱的熒光信號(hào)（圖3a），表明細(xì)胞周圍的膜是這一時(shí)期的主要靶點(diǎn)。然而，孵育24小時(shí)后，熒光信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)積累（圖3b），表明肽穿過(guò)外脂雙層的易位。此外，處理24小時(shí)后，細(xì)胞邊界變得明顯模糊，這可能是因?yàn)樵诖诉^(guò)程中細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)逐漸退化。因此，人們很好地預(yù)期，在易位后，肽會(huì)與細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)（如線粒體）相互作用，觸發(fā)細(xì)胞凋亡。

圖3。肽的原位定位和質(zhì)膜完整性。（a）用10mM FITC-G（IIKK）3I-NH2孵育1h后HeLa細(xì)胞中的肽位置。（b）用10mM FITC-G（IIKK）3I-NH2孵育24h后HeLa細(xì)胞中的肽位置。（c）未經(jīng)處理的HeLa細(xì)胞的代表性SEM顯微照片。（d）用10mM G（IIKK）3I-NH2處理24小時(shí)的HeLa細(xì)胞的代表性SEM顯微照片。

為了確定與肽結(jié)合后的膜通透性，我們進(jìn)行了鈣黃綠素AM釋放試驗(yàn)。與10 mM G（IIKK）3I-NH2孵育10 min導(dǎo)致約20%的鈣黃綠酸從HeLa細(xì)胞中釋放，表明其對(duì)癌細(xì)胞膜的快速滲透作用（參見(jiàn)補(bǔ)充數(shù)據(jù)，圖S2）。正如預(yù)期的那樣，增加培養(yǎng)時(shí)間會(huì)導(dǎo)致更多的膜通透性，在培養(yǎng)6小時(shí)后，鈣黃綠素AM的釋放超過(guò)40%。在較短的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，明顯的膜通透性與上述觀察到的肽與癌細(xì)胞膜的快速結(jié)合非常一致。

為了直接觀察G（IIKK）3I-NH2對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響，特別是在大多數(shù)肽分子轉(zhuǎn)移到膜上的較長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間后，我們進(jìn)行了SEM檢查。未經(jīng)處理的HeLa細(xì)胞顯示出正常的光滑表面，相鄰細(xì)胞之間具有良好的細(xì)胞間接觸（圖3c）。相比之下，用10 mM G（IIKK）3I-NH2處理24小時(shí)的HeLa細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)上表現(xiàn)出明顯的改變（圖3d）。觀察到收縮的細(xì)胞膜明顯破裂和溶解。除了細(xì)胞膜損傷外，一些處理過(guò)的細(xì)胞表現(xiàn)出嚴(yán)重的表面起泡（圖3d的右圖），這是細(xì)胞凋亡執(zhí)行階段的特征性事件[20]。

3.4.細(xì)胞凋亡

由于肽易位到細(xì)胞質(zhì)中，并且治療后的癌細(xì)胞出現(xiàn)了凋亡形態(tài)學(xué)，我們隨后遵循了細(xì)胞凋亡的幾個(gè)關(guān)鍵生化和形態(tài)學(xué)特征，旨在將凋亡誘導(dǎo)與HeLa細(xì)胞死亡聯(lián)系起來(lái)，并揭示可能的凋亡途徑。

3.4.1.核形態(tài)變化與DNA斷裂

染色質(zhì)凝聚與DNA片段化平行是用于識(shí)別細(xì)胞凋亡的可靠標(biāo)準(zhǔn)[21]。通過(guò)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行DAPI染色，我們首先比較了在37C溫度下用10 mM G（IIKK）3I-NH2處理24小時(shí)前后HeLa細(xì)胞的細(xì)胞核變化（圖4a）。未經(jīng)處理的HeLa細(xì)胞的細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則且完整，彌漫性DAPI染色。相反，隨著熒光強(qiáng)度的增加，肽處理的細(xì)胞核形狀發(fā)生改變，染色質(zhì)聚集成不規(guī)則的致密團(tuán)塊。此外，在不同的培養(yǎng)時(shí)間從處理過(guò)的HeLa細(xì)胞中提取基因組DNA，然后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。孵育12小時(shí)后，出現(xiàn)寡核苷酸大小的DNA片段，并且隨著孵育時(shí)間的增加，模式變得更加明顯（圖4b）。相比之下，從未經(jīng)處理的HeLa細(xì)胞中分離的DNA條帶是單一的，沒(méi)有發(fā)生DNA斷裂。有人提出，一旦染色質(zhì)完整性受損，一些激活酶（如內(nèi)源性核酸酶）負(fù)責(zé)將染色質(zhì)DNA切割成180e200 bp的片段及其整數(shù)倍[22e 24]。

圖4。細(xì)胞凋亡的生化和形態(tài)學(xué)特征。（a）HeLa細(xì)胞與10 mM G（IIKK）3I-NH2孵育24小時(shí)前后的DAPI核染色。（b）HeLa細(xì)胞與10 mM G（IIKK）3I-NH2孵育后提取的基因組DNA的凝膠電泳分析。（c）在與10 mM G（IIKK）3I-NH2孵育24小時(shí)之前和之后，用FITC phalloidin對(duì)HeLa細(xì)胞進(jìn)行F-肌動(dòng)蛋白染色。

3.4.2.細(xì)胞骨架改變

肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架在介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)內(nèi)部和外部信號(hào)的反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用[25]。它有一個(gè)動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，具有獨(dú)特的形式，適用于運(yùn)動(dòng)、粘附、分裂和細(xì)胞死亡等特定任務(wù)[26e28]。異常F-肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)的發(fā)生與細(xì)胞凋亡的發(fā)展密切相關(guān)，通常伴隨著ROS的線粒體釋放[28]。在與10 mM G（IIKK）3I-NH2孵育之前和之后，用FITC phalloidin對(duì)HeLa細(xì)胞進(jìn)行染色，以顯示F-肌動(dòng)蛋白（絲狀肌動(dòng)蛋白）。對(duì)于未經(jīng)處理的細(xì)胞，纖細(xì)的微絲束平行于細(xì)胞的長(zhǎng)軸，而F-肌動(dòng)蛋白隨著處理的細(xì)胞變得紊亂和縮短（圖4c）。

3.4.3.線粒體途徑

線粒體在細(xì)胞凋亡中起著核心作用，凋亡死亡中的許多關(guān)鍵因素和事件都受其調(diào)控。一些凋亡蛋白可以靶向線粒體，通過(guò)形成膜孔或增加線粒體膜通透性導(dǎo)致線粒體腫脹。這兩個(gè)過(guò)程都允許釋放凋亡效應(yīng)器[29e32]。在這項(xiàng)工作中，成功地觀察到線粒體途徑與細(xì)胞凋亡有關(guān)。我們首先以JC-1為探針，觀察線粒體膜電位的變化[33]。未經(jīng)處理的HeLa細(xì)胞顯示線粒體橙紅色熒光和少量綠色熒光（網(wǎng)絡(luò)版）。與10 mM G（IIKK）3I-NH2孵育24小時(shí)后，綠色熒光占主導(dǎo)地位（圖5a），表明線粒體膜電位顯著喪失。線粒體膜電位的這種去極化通常伴隨著線粒體膜通透性的增加和Cyt c的釋放[34]。然后，我們進(jìn)行了免疫熒光成像，該成像顯示未經(jīng)處理的細(xì)胞中Cyt c的清晰、顆粒狀染色模式，與G（IIKK）3I-NH2處理的細(xì)胞中Cyt c的更彌散染色形成對(duì)比（圖5b）。這種差異表明細(xì)胞色素c從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，與觀察到的線粒體膜電位去極化高度一致。在細(xì)胞質(zhì)中，釋放的Cyt-c可以在dATP存在下誘導(dǎo)Apaf-1和caspase-9之間的相互作用，從而進(jìn)一步激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)并觸發(fā)細(xì)胞凋亡[35]。

圖5.圖5。線粒體功能障礙與Fas-FasL通路。（a）用10mM G（IIKK）3I-NH2孵育24小時(shí)前后HeLa細(xì)胞的JC-1線粒體膜電位染色的熒光圖像。（b）用10mM G（IIKK）3I-NH2孵育24小時(shí)前后HeLa細(xì)胞的Cyt c免疫熒光染色。（c）Caspase-8，與10 mM G（IIKK）3I-NH2孵育后HeLa細(xì)胞的fas-L和fas基因轉(zhuǎn)錄。

3.4.4.死亡受體途徑

線粒體調(diào)節(jié)的細(xì)胞凋亡可通過(guò)其他受體相關(guān)途徑放大，如Fas與其配體（Fas-L）的相互作用[36]。為了研究該肽是否啟動(dòng)了死亡受體途徑，我們進(jìn)行了實(shí)時(shí)PCR分析，以分析相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄（caspase-8、fas和fas-L）。10mM G（IIKK）3I-NH2處理的HeLa細(xì)胞在3至6h內(nèi)的caspase-8轉(zhuǎn)錄水平明顯升高，而在孵育12h后急劇下降至正常值。fas和fas-L的轉(zhuǎn)錄遵循相同的趨勢(shì)（圖5c）。兩個(gè)基因（fas和fas-L）的高表達(dá)增加了它們相互作用的機(jī)會(huì)。這兩種分子的結(jié)合誘導(dǎo)了死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC）的形成，其中含有半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-10[36,37]。Fas圓盤(pán)啟動(dòng)了一個(gè)反饋回路，螺旋上升，增加了線粒體促凋亡因子的釋放和caspase-8的放大激活[38]。另一方面，半胱天冬酶-8誘導(dǎo)的凋亡也可以通過(guò)刺激線粒體釋放Cyt c來(lái)放大[39]。在G（IIKK）3INH2處理的HeLa細(xì)胞中，死亡受體通路基因的高轉(zhuǎn)錄意味著該肽誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡也參與了死亡受體依賴的方式。

3.5.免疫效應(yīng)

從活生物體中分離的天然抗菌肽在臨床上的應(yīng)用非常有限，因?yàn)樗鼈兊纳a(chǎn)成本高、溶血性高以及可能的免疫效應(yīng)[16]。除了通過(guò)高細(xì)胞選擇性降低生產(chǎn)成本和溶血作用外，所設(shè)計(jì)的螺旋肽的非免疫效應(yīng)對(duì)于開(kāi)發(fā)其潛在應(yīng)用也至關(guān)重要。兩個(gè)細(xì)胞因子基因IL2和IL8被認(rèn)為是主要的免疫系統(tǒng)信號(hào)分子，它們能夠?qū)ξ⑸锔腥咀龀龇磻?yīng)，并將外來(lái)分子（非自身）與人體自身細(xì)胞和分子（自身）區(qū)分開(kāi)來(lái)[40,41]。因此，這兩個(gè)基因的高表達(dá)通常會(huì)誘發(fā)急性和慢性炎癥。因此，在用肽G（IIKK）3I-NH2處理人類淋巴細(xì)胞后，使用RT-PCR分析其細(xì)胞因子基因IL2和IL8的轉(zhuǎn)錄水平。如圖S3所示，肽培養(yǎng)后淋巴細(xì)胞的IL2和IL8的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平低于或幾乎等于相應(yīng)對(duì)照組的水平，表明G（IIKK）3I-NH2與淋巴細(xì)胞的相互作用不會(huì)誘導(dǎo)非特異性免疫原性反應(yīng)。

3.6.體內(nèi)抗腫瘤性能

將人宮頸癌HeLa細(xì)胞接種于裸鼠皮下。腫瘤植入5天后，分別以1.5 mg/kg和5 mg/kg的劑量腹腔注射肽G（IIKK）3INH2和G（IIKK）4I-NH2。在給藥期間，未觀察到任何毒性跡象，如體重減輕和外觀不良（圖6b），盡管G（IIKK）4I-NH2顯示出更高的體外溶血性。與PBS中的陰性對(duì)照相比，這兩種肽對(duì)腫瘤生長(zhǎng)表現(xiàn)出明顯的抑制作用，其中G（IIKK）4I-NH2表現(xiàn)出比G（IIKK）3I-NH2更好的療效（圖6c），這與它們的體外抗腫瘤趨勢(shì)一致。18天后，解剖腫瘤并稱重（圖6a和d）。在1.5 mg/kg和5 mg/kg劑量下，G（IIKK）3I-NH2治療組的腫瘤生長(zhǎng)抑制率分別為0.23和0.31。G（IIKK）4I-NH2能產(chǎn)生更有效的抑制作用，在1.5 mg/kg和5 mg/kg劑量下，抑制率分別為0.32和0.41。這些數(shù)據(jù)表明，在小鼠異種移植模型中，螺旋肽可以有效地抑制腫瘤生長(zhǎng)，而腫瘤細(xì)胞不能被完全清除。許多抗腫瘤藥物的不完全抑制作用已被廣泛觀察到，這可歸因于多種機(jī)制，例如藥物從腫瘤部位相對(duì)較快地清除，以及它們難以通過(guò)壞死區(qū)域擴(kuò)散[42]，但目前這組肽背后的確切原因有待進(jìn)一步的機(jī)理研究。

圖6。人宮頸癌裸鼠移植瘤的體內(nèi)抗腫瘤作用。（a）給藥后解剖腫瘤。（b）給藥期間體重變化。（c）給藥期間腫瘤體積的變化。（d）給藥后的腫瘤抑制率。

4.討論

這些設(shè)計(jì)的肽短而規(guī)則。與典型的天然AMPs和流行的抗癌藥物順鉑相比，它們?cè)谝种瓢┘?xì)胞生長(zhǎng)方面的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、效力高、副作用小，使它們成為基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究的理想模型和靶點(diǎn)。這些肽在界面性質(zhì)和生物活性方面表現(xiàn)出系統(tǒng)性的變化。我們面臨的直接挑戰(zhàn)是如何將分子結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)、界面性質(zhì)和破壞細(xì)胞膜的選擇性聯(lián)系起來(lái)。這代表了功能性生物材料研究的核心努力，從而在未來(lái)肽抗生素的合理設(shè)計(jì)和對(duì)其抗腫瘤性能的理解中獲得更好的分子洞察力。

我們之前在共培養(yǎng)環(huán)境下使用NIH 3T3細(xì)胞系作為宿主細(xì)胞的研究表明，這些肽對(duì)細(xì)菌和癌細(xì)胞的作用模式大致相似，并解釋了為什么它們不會(huì)對(duì)正常哺乳動(dòng)物細(xì)胞造成傷害[8]。由于磷脂酰絲氨酸、O-糖基化粘蛋白、唾液化神經(jīng)節(jié)苷脂和硫酸肝素的表達(dá)升高，腫瘤細(xì)胞膜也攜帶凈負(fù)電荷。這種外膜表面的負(fù)電荷特征與細(xì)菌非常相似。這些肽和靶膜之間的靜電相互作用對(duì)選擇性反應(yīng)至關(guān)重要。

在所研究的短肽系列中，G（IIKK）3I-NH2代表了體外抗癌活性和細(xì)胞選擇性方面的最佳鏈長(zhǎng)，與之前報(bào)道的抗菌活性和選擇性觀察結(jié)果一致。已經(jīng)證明，對(duì)細(xì)菌和癌細(xì)胞的共同區(qū)別反應(yīng)源自肽通過(guò)靜電相互作用和疏水效應(yīng)之間的平衡對(duì)不同細(xì)胞膜的選擇性反應(yīng)。具體而言，負(fù)表面電荷和高度不飽和脂鏈驅(qū)動(dòng)的對(duì)癌細(xì)胞的高親和力導(dǎo)致G（IIKK）3I-NH2與癌細(xì)胞膜的快速結(jié)合，并隨后導(dǎo)致膜通透性。肽分子隨后通過(guò)脂質(zhì)雙層轉(zhuǎn)移，并積聚在癌細(xì)胞內(nèi)部。這一過(guò)程產(chǎn)生了一系列細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)和生化特征，表明肽處理的癌細(xì)胞因膜破壞和凋亡而死亡。此外，這項(xiàng)工作還揭示了肽誘導(dǎo)的癌細(xì)胞凋亡與兩個(gè)特征性的分子過(guò)程有關(guān)：線粒體途徑和死亡受體途徑。

這些肽在與淋巴細(xì)胞相互作用后不會(huì)誘導(dǎo)非特異性免疫原性反應(yīng)，重要的是，它們?cè)诼闶篌w內(nèi)對(duì)異種移植物顯示出相當(dāng)大的生長(zhǎng)抑制作用，對(duì)宿主毒性很小，因此表明它們?cè)谂R床開(kāi)發(fā)中具有巨大潛力。這些數(shù)據(jù)共同構(gòu)成了設(shè)計(jì)具有優(yōu)異生物相容性和選擇性的短肽生物材料的新范例的基礎(chǔ)。迄今為止，許多AMP通過(guò)從天然蛋白質(zhì)和肽中提取氨基酸序列來(lái)強(qiáng)調(diào)仿生作用。相比之下，在目前的工作中，我們采用了IIKK序列模塊基本單元的最小模擬，然后采用人工重復(fù)（n）和選擇性終端阻斷，從而大大提高了性能。未來(lái)的工作可以評(píng)估仿生學(xué)如何與合理的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)相協(xié)調(diào)。目前尚不清楚一級(jí)序列的變化，例如用L、V和A替換I，或用R替換K，以及任何帶有短側(cè)鏈的非天然陽(yáng)離子氨基酸，將如何改變效力和選擇性。

另一方面，雖然短肽對(duì)不同細(xì)胞類型的選擇性反應(yīng)符合實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果，但細(xì)胞外膜表面精細(xì)而復(fù)雜。目前基于選擇性靜電相互作用的解釋充其量只能是一種簡(jiǎn)化的合理化。需要進(jìn)一步研究，通過(guò)不同層次的模型界面表示來(lái)揭示詳細(xì)的分子過(guò)程，從而更直接地了解不同細(xì)胞和亞細(xì)胞界面上的不同相互作用。因此，目前的工作為探索新的科學(xué)理解開(kāi)辟了一系列具有挑戰(zhàn)性但令人興奮的實(shí)驗(yàn)機(jī)會(huì)。結(jié)合短設(shè)計(jì)功能肽開(kāi)發(fā)相關(guān)的模型生物界面將促進(jìn)新的實(shí)驗(yàn)?zāi)芰?，包括各種表面和界面成像、反射和散射，使用激光、x射線和中子束源。這些實(shí)驗(yàn)不僅將增加對(duì)生物界面過(guò)程的新理解，還將催生新技術(shù)。最后，之前的研究表明，表面活性劑樣短肽（如A9K）在抑制癌癥生長(zhǎng)方面也表現(xiàn)出很高的效力和選擇性[11]，但這些肽促進(jìn)了水和膜樣環(huán)境下的b-折疊構(gòu)象，而不是本研究中報(bào)道的a-螺旋構(gòu)象。目前還不清楚如何不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)可能導(dǎo)致等效的高效力和選擇性，但具有明確的分子結(jié)構(gòu)奠定了一個(gè)有用的基礎(chǔ)，為我們探討這些重要的差異，在未來(lái)的研究。對(duì)于從事跨學(xué)科研究的物理學(xué)家和材料研究人員來(lái)說(shuō)，這些合理設(shè)計(jì)的模型比已經(jīng)報(bào)道的各種天然AMP和同系物更易于處理。無(wú)論爭(zhēng)論的方向和結(jié)果如何，這些短肽都將引起廣泛的興趣來(lái)探索其功能用途。效力的變化有不同的含義。例如，很短的肽可以用于皮膚護(hù)理，而較長(zhǎng)的、效力更大的肽可以用于治療開(kāi)發(fā)。

5.結(jié)論

在一系列短肽G（IIKK）nI-NH2（n?1e4）中，G（IIKK）3I-NH2代表了體外抗癌活性和細(xì)胞選擇性方面的最佳鏈長(zhǎng)，與之前在抗菌活性和選擇性方面的觀察結(jié)果一致。已經(jīng)證明，對(duì)細(xì)菌和癌細(xì)胞的共同鑒別反應(yīng)源于肽通過(guò)靜電相互作用和疏水效應(yīng)之間的平衡而產(chǎn)生的選擇性反應(yīng)。具體而言，負(fù)表面電荷和高不飽和脂鏈驅(qū)動(dòng)的高親和力導(dǎo)致G（IIKK）3I-NH2與癌細(xì)胞膜的快速結(jié)合和隨后的膜通透性。然后，肽分子通過(guò)脂質(zhì)雙層轉(zhuǎn)運(yùn)，并在癌細(xì)胞內(nèi)部積聚。這一過(guò)程產(chǎn)生了一系列細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)和生化特征，表明肽處理的癌細(xì)胞因膜破壞和凋亡而死亡。此外，這項(xiàng)工作還揭示了肽誘導(dǎo)的癌細(xì)胞凋亡與兩個(gè)特征性的分子過(guò)程有關(guān)：線粒體途徑和死亡受體途徑。最后，該肽在與淋巴細(xì)胞相互作用后不會(huì)誘導(dǎo)非特異性免疫原性反應(yīng)，重要的是，這些設(shè)計(jì)的肽在異種移植模型中顯示出相當(dāng)大的體內(nèi)抗腫瘤作用，而毒性很小，這兩者都表明它們作為功能材料在生物技術(shù)和臨床應(yīng)用中的潛力。

致謝

這項(xiàng)工作得到了中國(guó)國(guó)家自然科學(xué)基金資助31271497,30900765號(hào)和21033005號(hào)，山東省自然科學(xué)基金（ZR2009 9DQ00 1和JQ201105）和中央大學(xué)基礎(chǔ)研究基金（12CX04052A）的資助。我們還感謝英國(guó)工程和物理科學(xué)研究委員會(huì)（EPSRC）的支持。我們感謝英國(guó)皇家學(xué)會(huì)（倫敦）為HX提供中英獎(jiǎng)學(xué)金。